中心法則?是?分子生物學的基礎(chǔ)理論之一，它描述了?遺傳信息在生物體內(nèi)的傳遞和表達過程。根據(jù)這一法則，遺傳信息的傳遞一直遵循著DNA→RNA→蛋白質(zhì)這個線性框架；此后，病毒中逆轉(zhuǎn)錄酶的發(fā)現(xiàn)補充了中心法則，證明生物體內(nèi)也能實現(xiàn)RNA→DNA的逆向流動。

而今，科學家們發(fā)現(xiàn)了一種顛覆式的現(xiàn)象：細菌的一種逆轉(zhuǎn)錄酶可以利用非編碼RNA創(chuàng)造出全新的編碼DNA。這項研究揭示了生物體遺傳信息傳遞的多樣性，強調(diào)了基因組非編碼基因的編碼潛力，打破了傳統(tǒng)法則中只能沿基因組DNA線性方向編碼遺傳信息的范式。

近日，哥倫比亞大學的科學家Stephen Tang和Samuel H. Sternberg團隊在 Science 上發(fā)表了題為“De novo gene synthesis by an antiviral reverse transcriptase”的最新成果，研究以肺炎克雷伯菌為研究對象，揭示了一種由DRT2（defense-associated reverse transcriptase 2）防御系統(tǒng)介導的抗病毒防御機制。

防御相關(guān)逆轉(zhuǎn)錄酶（Defense-associated Reverse Transcriptase, DRT）是細菌中除RT-Cas1和retron外的第三類具有抗噬菌體功能的逆轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)，被劃分為9個亞組（DRT1-9）。DRT系統(tǒng)中逆轉(zhuǎn)錄元件具有單基因操縱子的特征，這意味DRT系統(tǒng)可能僅依靠逆轉(zhuǎn)錄功能實現(xiàn)了噬菌體防御。但在此之前DRT系統(tǒng)中cDNA產(chǎn)物功能及免疫機制都是未知的。

該研究聚焦于肺炎克雷伯菌的DRT2系統(tǒng)（KpnDRT），因為該亞族系統(tǒng)結(jié)構(gòu)簡單，僅由單個編碼逆轉(zhuǎn)錄酶（Reverse Transcriptase，RT）的開放閱讀框（ORF）及其上游的非編碼RNA（non-coding RNA，ncRNA）構(gòu)成，后者此前未發(fā)現(xiàn)具有確切功能。與其它DRT系統(tǒng)或retron系統(tǒng)不同，DRT2系統(tǒng)缺乏額外的蛋白質(zhì)編碼基因，并且RT僅具有RNA導向DNA聚合酶的結(jié)構(gòu)域，也沒有預測到除此以外的其它功能結(jié)構(gòu)域。因此研究人員提出1個假設(shè)：逆轉(zhuǎn)錄酶合成的cDNA產(chǎn)物可能在DRT2免疫機制中起著關(guān)鍵、核心作用。

DRT2系統(tǒng)中ncRNA鏈的堿基之間互補配對，折疊形成一個具有很多保守莖環(huán)（stem-loop，SL）的二級結(jié)構(gòu)，其中由SL2短莖連接的、具有較大3’區(qū)域的RNA區(qū)域是RT合成cDNA的模板。RT以SL2相鄰區(qū)域的UCU作為起始位點，沿著模板區(qū)域3’→5’方向移動。回到SL2區(qū)域時，RT“躍過”SL2環(huán)狀結(jié)構(gòu)再次移動到起始位點UCU，繼續(xù)進行下一輪的逆轉(zhuǎn)錄。這種獨特的機制導致了cDNA片段不斷串聯(lián)累加，形成了串聯(lián)多個重復序列的cDNA，最長可達到40個重復。研究者將這一現(xiàn)象稱為滾環(huán)逆轉(zhuǎn)錄（rolling-circle reverse transcription，RCRT），類似于DNA的滾環(huán)復制。

有趣的是，細菌被T5噬菌體感染后，體內(nèi)除了ncRNA逆轉(zhuǎn)錄的cDNA外，還會出現(xiàn)大量與ncRNA鏈性相反、包含多個重復的RNA序列，可達到未感染細菌的~10000倍。隨后實驗結(jié)果也表明合成的cDNA互補鏈可能是RNA聚合酶另一輪轉(zhuǎn)錄的模板鏈，所得轉(zhuǎn)錄本將具有與初始ncRNA相反的鏈性，并可以包含不同數(shù)量的cDNA重復序列。那么串聯(lián)的重復cDNA轉(zhuǎn)錄形成的RNA在抗噬菌體免疫反應(yīng)中又有著怎樣的作用呢？利用算法預測，單個cDNA具有一種沒有任何終止密碼子的ORF區(qū)域。RCRT在每次“跳躍”時會增加1個額外堿基，產(chǎn)生了1個120bp的cDNA重復單元，該重復單元恰好包含40個正義密碼子。這種重復單元確保了每次串聯(lián)復制中ORF的完整性，并產(chǎn)生了連續(xù)的ORF。令人驚奇的是，一個cDNA重復單元的末端與下一個cDNA重復單元的起始端形成了1個全新的啟動子，具有典型的-10和-35區(qū)域。至此，這些基于RCRT機制產(chǎn)生的串聯(lián)重復cDNA形成了1個全新的編碼基因，并且ORF內(nèi)沒有任何終止密碼子，研究者們將其命名為Neo（never-ending ORF）。

進一步的蛋白表達實驗證實，當串聯(lián)的cDNA重復數(shù)等于或大于3時，neo基因編碼的蛋白質(zhì)會誘導宿主細胞通過關(guān)閉代謝過程來阻止噬菌體復制，并進入程序性休眠，從而中斷病毒的傳播過程。根據(jù)KpnDRT2產(chǎn)生Neo蛋白的機制信息，研究者們進一步在DRT2同源物中分析這種免疫機制內(nèi)部基因合成策略的進化保守程度。分析確認了絕大多數(shù)物種都具有與KpnDRT2相關(guān)的ncRNA和Neo蛋白，結(jié)果表明這種獨特防御機制具有廣泛的保守性。值得注意的是，對于Neo蛋白合成和表達至關(guān)重要的序列，如“跳躍”過程中的ACA-1、ACA-2以及串聯(lián)重復中的啟動子元件，在其它的同源物中也具有極高保守性。

該研究揭示了KpnDRT2防御系統(tǒng)介導的一種前所未有的抗病毒免疫機制。在未感染時，細菌KpnDRT2防御系統(tǒng)中的ncRNA和RT由單個啟動子組成型表達，通過介導RCRT過程精準、程序化“跳躍”合成具有異質(zhì)性大小的、重復的單鏈cDNA。噬菌體感染后，cDNA第2鏈合成被觸發(fā)，從而導致串聯(lián)重復的雙鏈cDNA大量積累。隨后，相鄰cDNA連接處新形成的啟動子招募RNA聚合酶，大量表達異質(zhì)性大小的mRNA，這些mRNA可以編碼一類無終止密碼子、永無止境的ORF（neo）。進一步地，Neo蛋白通過阻止細胞生長和誘導程序性休眠來保護細菌種群免受噬菌體的傳播和侵染。

這項研究闡述了一種新穎的基于DRT2系統(tǒng)的抗病毒免疫機制，這種機制證明了遺傳信息DNA和RNA兩種載體之間遺傳信息傳遞的復雜性，拓展了我們對中心法則的認知。同時，Neo蛋白的發(fā)現(xiàn)打破了蛋白編碼基因定義的傳統(tǒng)特征，也引發(fā)我們對基因組組成的更廣泛思考。以人類基因組為例，僅有~1.5%的基因組序列被認為是蛋白質(zhì)編碼基因，那么剩余的98.5%基因組序列是否還有更多類似于Neo蛋白的非典型蛋白質(zhì)編碼基因？我們覺得答案是肯定的。多久后能夠出現(xiàn)基于DRT系統(tǒng)的新基因工具，又是否能夠像CRISPR/Cas系統(tǒng)一樣給生物學帶來巨大的變革，令人期待。

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